UNIVERSIDAD ESTATAL DE BOLÍVAR Facultad de ciencias agropecuarias recursos naturales y del ambiente Carrera de Agroindustrias Tema: EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA EMBOTELLADA EN LA PROVINCIA BOLÍVAR A TRAVÉS DE ANÁLISIS BIOMOLECULARES (PCR) Y CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS. Proyecto de investigación previo a la obtención del título de ingeniero Agroindustrial, otorgado por la Universidad Estatal De Bolívar, a través de la Facultad de Ciencias Agropecuarias Recursos Naturales y del Ambiente, Carrera de Agroindustrias Autor: Llanos García Francisco Andrés. Tutor: Ing. Darwin Alberto Núñez Torres Mg. Guaranda – Ecuador 2024 I II III IV V DEDICATORIA El presente trabajo investigativo va dedicado primeramente a Dios ya que sin él no hubiese sido posible llegar hasta esta etapa de mi vida brindándome siempre sabiduría, salud, inteligencia y cuidando siempre de mí y de mi familia dándome siempre fuerzas y energía para seguir adelante. A mis padres Ángel Llanos, Teresa García, hermanos y tíos por haberme apoyado de manera incondicional tanto moralmente como económicamente siendo un pilar importante en esta etapa, sin ellos este paso tan importante en mi vida no hubiese sido posible, a mis docentes quienes supieron impartir sus conocimientos los cuales son y fueron necesarios e indispensables para poder llegar a culminar esta carrera. Francisco Llanos VI AGRADECIMIENTO Agradezco a Dios por cuidarnos y darnos sabiduría, guiándonos a lo largo de toda la vida siempre por un buen camino, dándonos fortaleza en los momentos más difíciles que se han presentado en todo el proceso. A nuestros padres por ser quienes nos apoyaron siempre presentándose en ocasiones adversidades, pero logrando de una manera u otra salir adelante dándonos siempre palabras de motivaciones para no caer en el trascurso de toda esta etapa gracias infinitas. Nuestro más sincero y profundo agradecimiento a nuestra alma mater la Universidad Estatal De Bolívar, a la Facultad De Ciencias Agropecuarias Recursos Naturales y del Ambiente y especialmente a la Carrera de Agroindustrias quien nos acogió y nos abrió las puertas para que nos formemos y seamos parte de ella. De manera especial a todos nuestros docentes que gracias a su sabiduría, experiencia y conocimientos nos supieron enseñar y motivarnos tanto profesionalmente como personalmente reflejando siempre principios y valores que son muy importantes para el resto de nuestras vidas. Francisco Llanos VII ÍNDICE DE CONTENIDOS: Contenido Pág. DEDICATORIA ..................................................................................................... V AGRADECIMIENTO .......................................................................................... VI ÍNDICE DE CONTENIDOS: .......................................................................... VII ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................ XIII ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................ XV RESUMEN ....................................................................................................... XVIII ABSTRACT ....................................................................................................... XIX CAPÍTULO I ............................................................................................................ 1 1.1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1 1.2. PROBLEMA. .................................................................................................... 3 1.2.1. Descripción del problema. ............................................................................. 3 1.3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 5 1.3.1. Objetivo general. ....................................................................................... 5 1.3.2. Objetivos Específicos. ............................................................................... 5 1.4. HIPÓTESIS. ...................................................................................................... 6 1.4.1. Hipótesis nula (H0) ................................................................................ 6 1.4.2. Hipótesis Alterna (Hi) ........................................................................... 6 CAPITULO II .......................................................................................................... 7 2. MARCO TEÓRICO. ....................................................................................... 7 2.1. Agua ......................................................................................................... 7 2.1.1. Generalidades del agua ......................................................................... 7 2.1.2. Agua embotellada.................................................................................. 7 2.1.3. Calidad del agua .................................................................................... 8 2.1.4. Estándares de calidad para el agua embazada. .................................... 10 VIII 2.1.5. Tipos de agua embotellada. ................................................................ 10 2.1.6. Clasificación del agua embotellada. ................................................... 11 2.1.9. Regulaciones para el agua embotellada. ............................................. 15 2.1.10. Requisitos sanitarios de los procesadoras de agua. ........................... 15 2.1.11. Embotelladoras de agua en la Provincia Bolívar. ................................. 16 2.2. Biología molecular. ................................................................................ 17 2.2.1. Análisis (PCR) Reacción en Cadena de la Polimerasa en aguas. ....... 18 2.2.2. Electroforesis....................................................................................... 19 2.2.3. Microbiología del agua ....................................................................... 19 2.2.4. Microorganismos .................................................................................... 19 2.2.5. Bacterias ............................................................................................. 19 2.2.6. Bacterias .............................................................................................. 21 2.3. Tipos de cultivo .......................................................................................... 24 2.3.1. Cultivo puro oaxénico ......................................................................... 24 2.3.2. Cultivo mixto ...................................................................................... 24 2.4. Técnicas de cultivo en placa .................................................................... 24 2.4.1. Técnica por estría en superficie........................................................... 24 2.4.2. Técnica de siembra para aislamiento por estría múltiple. ................... 25 2.4.3. Técnica de cuatro cuadrantes. ............................................................. 25 2.4.4. Técnica por agotamiento o en superficie. ........................................... 26 2.4.5. Técnica de siembra masiva. ................................................................ 26 2.4.6. Técnica de siembra por punción. ........................................................ 27 2.4.7. Técnica de siembra por dilución ......................................................... 27 2.5. Técnicas de siembra para tubos.............................................................. 28 2.5.1. Siembra en tubos por estría simple. .................................................... 28 2.5.2. Siembra en tubos por picadura. ........................................................... 28 IX 2.5.4. Siembra por inoculación o agitación. .................................................. 29 2.6. Tipos de medio de cultivo según su función. ............................................. 30 2.6.1. Medio general...................................................................................... 30 2.6.2. Medio selectivo. .................................................................................. 30 2.6.3. Medio diferencial ................................................................................ 30 2.6.4. Medio de enriquecimiento o nutritivo. ................................................ 30 2.6.5. Medio mínimo. .................................................................................... 31 2.7. Tipos de agar .............................................................................................. 31 2.7.1. Agar/Caldo LB (Luria Bertani) o Agar caldo Millers LB. ................. 31 2.7.2. Agar sangre. ........................................................................................ 31 2.7.3. Agar chocolate .................................................................................... 31 2.7.4. Agar MacConkey ................................................................................ 31 2.7.5. Agar sabouraud ................................................................................... 32 2.7.6. Agar entérico de hektoen. ................................................................... 32 2.7.7. Agar Müller -Hinton. .......................................................................... 32 2.7.8. Agar Xilosa -Lisina-Desoxicolato (XLD). .......................................... 32 2.7.9. Agar verde brillante............................................................................. 33 2.7.10. Agar triptona -soja (TSA) ................................................................. 33 2.7.11. Listeria agar cromogénico................................................................. 33 CAPITULO III ....................................................................................................... 34 3. MARCO METODOLÓGICO ....................................................................... 34 3.1.1 Localización de la investigación .......................................................... 34 3.1.2. Situación geográfica y climática. ........................................................ 34 3.1.3. Zona de vida ........................................................................................ 35 3.2. Materiales ............................................................................................... 35 3.2.1. Material experimental. ........................................................................ 35 X 3.2.2. Materiales de oficina. .......................................................................... 35 3.2.3. Materiales de Laboratorio. .................................................................. 35 3.2.3. Equipos ................................................................................................ 36 3.3. Métodos ...................................................................................................... 37 3.3.1. Factores en estudio .................................................................................. 37 3.3.2. Tratamientos ............................................................................................ 37 3.3.3. Características del experimento. ......................................................... 38 3.3.4. Tipo diseño experimental o estadístico. .................................................. 38 3.4. Métodos de evaluación y datos a tomarse. ................................................. 39 3.4.1. Variable de respuesta. ......................................................................... 39 3.5. Georreferenciación ................................................................................. 40 3.5.1. Recolección de datos ........................................................................... 40 3.6. Manejo del experimento. ............................................................................ 40 3.6.1. Obtención De Muestras. ...................................................................... 40 3.6.2. Codificación e identificación de las muestras ..................................... 40 3.6.3. Registro de las muestras. ..................................................................... 41 3.9. Análisis Microbiológicos ........................................................................... 46 3.9.1. Aislamiento de E. Coli ........................................................................ 46 3.9.2. Aislamiento de Listeria. ..................................................................... 47 3.9.3. Aislamiento de Salmonella ................................................................. 48 3.9.4. Tinción de Gram. ................................................................................ 49 3.10. Análisis Molecular (PCR) Reacción en cadena de la polimerasa. ...... 49 3.11. Tabulación. ........................................................................................... 52 CAPITULO IV ....................................................................................................... 53 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 53 4.1. Resultados de georreferenciación con coordenadas mediante GPS. ........ 53 XI 4.3. Resultados microbiológicos ....................................................................... 56 4.3.1. Cuantificación de Listeria de las muestras de agua embotellada de las diferentes empresas que existen en la provincia Bolívar .............................. 56 4.3.2. Aislamiento, purificación e identificación microscópica de las colonias de Listeria presentes en las muestras de agua embotellada de las empresas que expenden en la provincia Bolívar. .......................................................... 57 4.3.3. Cuantificación de E. coli de las muestras de agua embotellada de las diferentes empresas. ...................................................................................... 60 4.3.4. Aislamiento, purificación e identificación microscópica de las colonias de E. Coli presentes en las muestras de agua embotellada de las empresas que expenden en la Provincia Bolívar. .......................................................... 61 4.3.5. Cuantificación de Salmonella de las muestras de agua embotellada de las diferentes empresas. ................................................................................. 64 4.3.6. Aislamiento, purificación e identificación microscópica de las colonias de Salmonella presentes en las muestras de agua embotellada de las empresas que expenden en la provincia Bolívar ........................................................... 65 4.3.7. Identificación de Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Escherichia coli mediante Reacción de Cadena Polimerasa (PCR). ............ 67 4.3.8. Concentración y calidad de ADN extraída mediante Genomic DNA Mini kit k182001 ........................................................................................... 68 4.4. Análisis molecular ...................................................................................... 70 4.4.1. Detección de Listeria monocytogenes mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR). ......................................................................................... 70 4.4.3. Detección de Salmonella spp. mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR). ......................................................................................... 72 4.4.4. Frecuencias y porcentajes para casos positivos .................................. 75 4.5. COMPROBACIÓN DE LA HIPÓTESIS .................................................. 79 4.5.1. Hipótesis nula (H0) .................................................................................. 79 4.5.2. Hipótesis Alterna (Hi) ............................................................................. 79 XII 4.5.3. Verificación de hipótesis ......................................................................... 79 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................ 80 5.1. Conclusiones .......................................................................................... 80 5.2. Recomendaciones ................................................................................... 81 6. BIBLIOGRAFÍA. .............................................................................................. 82 7. ANEXOS. .......................................................................................................... 95 7.6. Glosario de términos Técnicos ................................................................. 113 XIII ÍNDICE DE TABLAS Tabla N° Descripción Pág. 1 Requisitos físicos para el agua purificada ............................................................ 8 2 Requisitos microbiológicos .................................................................................. 9 3 Clasificación Taxonómica de Escherichia coli ................................................. 21 4 Requisitos microbiológicos para el agua purificada envasada y el agua purificada mineralizada envasada .......................................................................................... 22 5 Taxonomía de Listeria monocytogenes .............................................................. 22 6 Taxonomía Salmonella...................................................................................... 23 7 Aspectos generales del territorio ........................................................................ 34 8 Datos de la situación climática y geográfica. ..................................................... 34 9 Factores de estudio ............................................................................................. 37 10 Tratamientos ..................................................................................................... 38 11 Características del diseño ................................................................................. 38 12 Modelo de Análisis de varianza ANOVA. ....................................................... 39 13 Codificación, identificación registro de las muestras y origen. ....................... 41 14 Cebadores específicos utilizados en esta investigación ................................... 50 15 Reactivos PCR para Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella spp. ............................................................................................................................... 51 16 Condiciones para el proceso de (PCR) para Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella spp. ............................................................................................. 51 17 Resultados de georreferenciación con coordenadas mediante GPS. .............. 53 18 Valores obtenidos mediante resultados microbiológicos del primer, segundo y tercer muestreo. ..................................................................................................... 56 19 Identificación y diferenciación microscópica mediante tinción de gram de las colonias aisladas de Listeria de las muestras de agua purificada y embotellada. . 57 20 Anova para Listeria. ......................................................................................... 58 21 Pruebas de Múltiple Rangos para Listeria por el método de Tukey HSD. ...... 58 22 Valores obtenidos mediante resultados microbiológicos del primer y segundo muestreo. ............................................................................................................... 60 XIV 23 Identificación y diferenciación microscópica mediante tinción de gram de las colonias aisladas de E. Coli de las muestras de agua purificada y embotellada. .. 61 24 Anova Escherichia coli. ................................................................................... 62 25 Pruebas de Múltiple Rangos para Escherichia coli por el método de Tukey HSD. ...................................................................................................................... 62 26 Valores obtenidos mediante resultados microbiológicos del primer y segundo muestreo. ............................................................................................................... 64 27 Identificación y diferenciación microscópica mediante tinción de gram de las colonias aisladas de Salmonella spp. de las muestras de agua purificada embotellada. .......................................................................................................... 65 28 Anova para Salmonella spp. ............................................................................. 65 29 Pruebas de Múltiple Rangos para Salmonella por el método de Tukey HSD. 66 30 Concentración de ADN mediante Espectrofotómetro Nanodrop para Listeria monocytogenes. ..................................................................................................... 68 31 Concentración de ADN mediante Espectrofotómetro Nanodrop para Escherichia coli ......................................................................................................................... 69 32 Concentración de ADN mediante Espectrofotómetro Nanodrop para Salmonella ............................................................................................................................... 69 33 Resultados de ADN extraído y analizado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de Listeria monocytogenes. ..................................................... 73 34 Resultados de ADN extraído y analizado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de Escherichia coli. ................................................................. 74 35 Resultados de ADN extraído y analizado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de Salmonella spp. ................................................................... 75 36 Tabla de frecuencias y porcentajes para casos positivos de Listeria monocytogenes por PCR. ...................................................................................... 75 Tabla 37 Tabla de frecuencias y porcentajes para casos positivos de Escherichia coli. ........................................................................................................................ 76 38 Tabla de frecuencias y porcentajes para casos positivos de Salmonella spp. 76 XV ÍNDICE DE FIGURAS Figura N° Descripción Pág. 1 Estructura del agua. .............................................................................................. 7 2 Calidad del agua ................................................................................................. 10 3 Tipos de Agua embotellada ................................................................................ 11 4 Agua gasificada. ................................................................................................. 12 5 Cámara de ozono para el agua. .......................................................................... 14 6 Esquema del Mecanismo PCR. .......................................................................... 18 7 Bacterias presentes en el agua. ........................................................................... 20 8 Contaminación por Salmonella. ......................................................................... 24 9 Cultivo por estría en superficie. ......................................................................... 25 10 Aislamiento por estría múltiple. ....................................................................... 25 11 Cultivo mediante cuatro cuadrantes. ................................................................ 26 12 Siembra por agotamiento en superficie ............................................................ 26 13 Siembra masiva en placa. ................................................................................. 27 14 Siembra por punción en placa. ......................................................................... 27 15 Siembra por dilución ........................................................................................ 28 16 Siembra en tubos por estría simple. ................................................................. 28 17 Siembra por picadura en tubo. ......................................................................... 29 18 Siembra por picadura y estría. .......................................................................... 29 Siembra por agitación. .......................................................................................... 30 20 Georreferenciación de las empresas embotelladoras de agua en la Provincia Bolívar ................................................................................................................... 55 21 Medias de los porcentajes de Listeria .............................................................. 59 22 Medias de los porcentajes de Escherichia coli. ............................................... 63 23 Medias de los porcentajes de Salmonella spp. ................................................. 67 24 Resultados de electroforesis después de realizar PCR con los aislados de Listeria donde pb es el marcador de peso molecular, L+ es el control positivo y T son las muestras de ADN. ..................................................................................... 71 XVI 25 Resultados de electroforesis después de realizar PCR con los aislados de Escherichia coli donde pb es el marcador de peso molecular E+ es el blanco positivo y T son las muestras de ADN. ................................................................. 72 26 Resultados de electroforesis después de realizar PCR con los aislados de Salmonella spp. donde pb es el marcador de peso molecular S+ es el control positivo y T son las muestras de ADN. ................................................................. 73 XVII ÍNDICE DE ANEXOS Anexo N° Descripción Pág. 1 Mapa de ubicación de la investigación ............................................................... 95 2 Cronograma de actividades ................................................................................. 97 3. Presupuesto ........................................................................................................ 98 4 Formatos de fichas de recolección de datos. ..................................................... 100 5 Georreferenciación ............................................................................................ 105 6 Análisis físico-químicos .................................................................................... 106 7 Análisis microbiológicos ................................................................................... 107 8 Extracción de ADN mediante mini kit y electroforesis ................................... 110 XVIII RESUMEN El presente proyecto investigativo titulado “Evaluación De La Calidad Del Agua Embotellada en la Provincia Bolívar a Través de Análisis Biomoleculares (PCR) y Cultivos Microbiológicos, tiene como objetivo evaluar la calidad microbiológica del agua embotellada de las diferentes empresas que existen en la Provincia Bolívar a través de análisis biomoleculares (PCR) y cultivos microbiológicos, teniendo como principales objetivos, determinar la calidad del agua mediante el uso de medios de cultivos específicos para el desarrollo de microorganismos. Caracterizar si existe la presencia de Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Escherichia coli mediante técnicas de biología molecular (PCR) Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo final. Se planteo un diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial A x B (5 x2) con tres repeticiones. La técnica molecular fue el resultado tras la purificación de microrganismos obtenidos de las muestras mediante medios de cultivos selectivos y diferenciales todas estas en unidades UFC/mL. Con el empleo de estas dos metodologías se analizó un total de 11 marcas de agua embotellada de la provincia Bolívar las cuales fueron provenientes de cada una de las empresas embotelladoras. Se utilizo cebadores específicos de la marca invitrogen para detectar el gen tanto de Listeria monocytogenes, Salmonella spp y Escherichia coli con su serotipo O157:H7 y utilizando para un mejor resultado blancos positivos de los tres microrganismos que fueron adquiridos por el departamento de investigación. Se logro detectar Listeria monocytogenes en un 54% (6/11), para Escherichia coli 36 % (4/11) y para Salmonella spp. 18% (6/11) para cada una de las muestras mismas que fueron interpretadas mediante electroforesis. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue más sensible para Escherichia coli, O157:H7 y Listeria monocytogenes dando resultados exactos en conjunto con los blancos positivos. En conclusión, la presencia de estas bacterias en el agua embotellada puede considerarse un factor de riesgo para la salud y bienestar para el consumidor. Palabras clave: Listeria monocytogenes, Escherichia coli, cultivos selectivos, Análisis Biomoleculares, electroforesis. XIX ABSTRACT The present research project entitled "Evaluation of Bottled Water Quality in the Bolivar Province through Biomolecular Analysis (PCR) and Microbiological Cultures, aims to evaluate the microbiological quality of bottled water from different companies in the Bolivar Province through biomolecular analysis (PCR) and microbiological cultures, having as main objectives to determine the quality of water through the use of specific culture media for the development of microorganisms. To characterize the presence of Listeria monocytogenes, Salmonella spp. and Escherichia coli by means of molecular biology techniques (PCR) Polymerase Chain Reaction in final time. A completely randomized design (CRD) with factorial arrangement A x B (5 x 2) with three replicates was used. The molecular technique was the result after purification of microorganisms obtained from the samples by means of selective and differential culture media, all of them in CFU/mL units. With the use of these two methodologies, a total of 99 samples of bottled water were analyzed equally from each of the water bottling companies in the different cantons of the Bolivar province. Specific primers of the Invitrogen brand were used to detect the serotype of both Listeria monocytogenes, Escherichia coli with its serotype O157:H7 and Salmonella spp using positive targets of the three microorganisms that were acquired by the research department for a better result. Listeria monocytogenes was detected in 91,6% (12/11), for Escherichia coli 75% (9/99) and for Salmonella spp. 50% (6/11) for each of the samples, which were interpreted by electrophoresis. The polymerase chain reaction (PCR) was more sensitive for Escherichia coli, O157:H7 and Listeria monocytogenes giving accurate results in conjunction with the positive blanks. In conclusion, the presence of these bacteria in bottled water can be considered a health and welfare risk factor for the consumer. Key words: Listeria monocytogenes, Escherichia coli, selective cultures, Biomolecular Analysis, electrophoresis. 1 CAPÍTULO I 1.1. INTRODUCCIÓN A nivel mundial las enfermedades son causadas por un inadecuado tratamiento de agua, esto ocasiona una contaminación cruzada en las redes de distribución y planta afectando a quien lo consume. La OMS define al agua para consumo como aquella que no produce ningún daño significativo en el organismo siendo esta consumida durante toda la vida. El mal manejo de la calidad del agua puede conllevar enfermedades que afectan directamente a la salud de las personas. Las normas establecidas y destinadas para el adecuado manejo del agua de consumo ayudan a mantener un control y proporcionan así beneficios para la salud (Organizacion Mundial de la Salud (OMS), 2018). Es por esa razón que la mayor parte de la población tiene desconfianza al momento consumir agua no tratada debido a su calidad, por esta razón las personas optan por consumir agua embotellada de marcas reconocidas, dejando a un lado a las nuevas marcas de aguas. Hoy en día existe un alto crecimiento de las industrias procesadoras de agua embotellada para consumo teniendo un porcentaje anual de un 7% a nivel mundial existiendo así la posibilidad de que estas no manejen un buen control de aguas y no cumplen con los estándares requeridos provocando que en el agua exista contaminación de diferentes compuestos. En el Ecuador se asemeja a la misma realidad. Según Euromonitor Internacional en el último reporte en el año 2018 el consumo de agua purificada embotellada se ubicó en 41 litros por persona disminuyendo significativamente el consumo de bebidas azucaradas y gaseosas (Espol, 2022). Pero así mismo ha generado desconfianza debido a que algunos embaces de agua presentan sabores ajenos al mismo generando una duda de la calidad de agua de lo que se está consumiendo. En algunos casos las marcas de algunas empresas de agua no poseen información del producto como es su fecha de expedición, vencimiento y el número de lote en el que fue embazado dando la idea de que no se están cumpliendo las normas y los estándares de calidad. El agua que se utiliza para ser embotellada puede contener contaminantes ya sean estos de nivel químico o microbiológicos llegando a desarrollarse un crecimiento de diferentes patógenos y concentraciones de diferentes sustancias químicas que son perjudiciales para la salud. Esta posible contaminación variara dependiendo las marcas de agua, lugar, 2 origen, equipos que se utilizan para la manipulación del mismo, ventilación, exposición con animales durante el proceso de embotellado también al momento de su almacenamiento y transporte. Así mismo hoy en día el uso de las técnicas biomoleculares ayudan a permitir el estudio y detección de secuencias específicas de ADN ya sean cortas o alargadas y genomas completos permitiendo la detección y replicación del material genético como son sus ácidos nucleicos que constituyen las características específicas como son su especie y las modificaciones que se las puede realizar .Es por ello que en el presente trabajo de carácter investigativo se tiene como objeto estudiar y analizar la calidad del agua de las procesadoras de agua embotellada que existen Provincia Bolívar y que a su vez son expendidas a nivel de la Provincia determinando así los principales patógenos que pueden afectar al agua y estudiándolos mediante técnicas biomoleculares. 3 1.2. PROBLEMA. 1.2.1. Descripción del problema. Actualmente las personas llevan un ritmo de vida acelerado ya sea por circunstancias de trabajo, deporte o viajes hace que su consumo de agua sea más requerido, siendo esta la principal fuente de hidratación, dando lugar a la producción a gran escala de un producto envasado que se lo puede adquirir en cualquier tienda de abastos, estando a si al alcance de todas las personas sin importar el tiempo de vida útil ni la manera que se encuentra almacenada, existiendo riesgos de consumir estos productos por un mal tratamiento de conservación. En el Ecuador las diferentes compañías que producen y embotellan agua para consumo tienen a su favor las diferentes temperaturas que se manejan por regiones y gracias a ello se mueve el consumo de bebidas, motivando así a las empresas a crear nuevos productos. Según la Agencia De Regulación Y Control Sanitario a nivel nacional existen un total de 985 plantas purificadoras y embotelladoras de agua (ARCSA, 2020). El 22,2% de hogares tienen la incertidumbre de consumir agua embotellada por la razón de que al momento de ser comercializada estas no cumplen con las normas vigentes, observándose en ocasiones que en el envase no poseen registros sanitarios, fecha de elaboración, caducidad, número de lote y etiquetados mal realizados dando lugar a una poca aceptabilidad del producto y a la misma vez analizando si el producto es manejado bajo estándares de calidad (Molina & Pozo, 2018). Según estudios de entidades como Unicef y Banco Mundial el 17,8% de agua embotellada en Ecuador posee contaminantes tanto químicos como microbiológicos. (Relief, 2017). El consumo de agua embotellada ha aumentado considerablemente en la provincia Bolívar. En donde, existen diferentes empresas embotelladoras del mismo que lo procesan siendo estas expendidas a los diferentes puntos de venta. Mediante observaciones se puede constatar que la venta del agua embotellada puede sufrir afectaciones como contaminación cruzada y turbar su composición debido a que estos productos son expuestos a la luz del sol (rayos solares) generando así que la botella de plástico suelte sustancias como bisfenol A (BPA) y dioxinas que son peligrosas cuando entran en calor; así mismo las altas temperaturas ayudan al desarrollo 4 microorganismos como Escherichia coli, coliformes totales ,fecales afectando al organismo del individuo (Gibbens, 2022). Las botellas con agua para el consumo tienen condiciones estrictas para su acopio teniendo mucho que ver las temperaturas en las que son almacenadas dependiendo mucho de ello su calidad. Es por ello que en esta investigación se pretende analizar e identificar mediante análisis biomoleculares (PCR) y microbiológicos la calidad del agua de las diferentes empresas embotelladoras de agua que procesan y expenden en la provincia para a si verificar la calidad del mismo. 5 1.3. OBJETIVOS 1.3.1. Objetivo general. Evaluar la calidad microbiológica del agua embotellada en la Provincia Bolívar a través de análisis biomoleculares (PCR) y cultivos microbiológicos. 1.3.2. Objetivos Específicos. 1. Determinar la calidad del agua mediante el uso de medios de cultivos específicos para el desarrollo de microorganismos. 2. Caracterizar si existe la presencia de Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Escherichia coli mediante técnicas de biología molecular (PCR) Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo final. 6 1.4. HIPÓTESIS. 1.4.1. Hipótesis nula (H0) Cada (PCR) reacción en cadena de la polimerasa en tiempo final en el agua de las empresas embotelladoras de la Provincia Bolívar para consumo humano no se confirma la presencia de Listeria, Salmonella y Escherichia coli que afectan la calidad microbiológica del agua embotellada purificada. 𝑯𝟎: µ𝟏 =µ𝟏 1.4.2. Hipótesis Alterna (Hi) Cada (PCR) reacción en cadena de la polimerasa en tiempo final en el agua de las empresas embotelladoras de la Provincia Bolívar para consumo humano se confirma la presencia de Listeria, Salmonella y Escherichia coli que afectan la calidad microbiológica del agua embotellada purificada. 𝑯𝒊: µ𝟏 ≠µ𝟏 7 CAPITULO II 2. MARCO TEÓRICO. 2.1. Agua 2.1.1. Generalidades del agua El agua es considerada una sustancia liquida que posee características como no tener sabor, olor y color encontrándose en la naturaleza, su molécula está compuesta por dos átomos de hidrogeno y también uno de oxígeno unidos a si mediante un enlace covalente. Esta molécula del agua tiene una estructura denominada dipolar dándolo a si una gran ventaja para disolver cualquier tipo de sustancias conociéndole como disolvente universal (IGME, 2022). Figura 1 Estructura del agua. Nota: Tomado de: Peralta (2022). 2.1.2. Agua embotellada El Agua embotellada o preservada mediante envases plásticos es agua potable que es depositada en botellas individuales de diferentes tamaños teniendo diferentes calidades en un promedio de medio-alto dependiendo la temperatura en la que será almacena ya sea en frío o al ambiente estas pueden ser agua purificada, manantial, pozo, glacial o grifo. Según Torres (2018), el material que es fundamental a utilizar para el proceso de embotellamiento de agua es tereftalato de polietileno comúnmente dirigido para botellas de agua por lo que no presenta riesgos algunos para la salud. Pero en caso de que exista una contaminación son difíciles de analizar y es muy complejo detectar los componentes tóxicos que estos poseen, pero si hay la posibilidad de que contenga bisfenol (Waterlogic, 2019). 8 2.1.3. Calidad del agua La calidad del agua es la que está adecuada y enfocada para el consumo humano cumpliendo características químicas, microbiológicas, físicas y organolépticas. Dependiendo las características según su uso y función de su calidad que presenta el agua tenemos: Aguas residuales, potables, embotelladas, de usos para riego todos estos basados mediante normativas de regulación que son determinadas por el (MAE) Ministerio Del Ambiente y Agua, INEN y el (ARCSA) que es la Agencia nacional de regulación control y vigilancia sanitaria los cuales son los entes encargados de los análisis de caracterización de las aguas a tratarse dándonos a conocer mediante indicadores la concentración o calidad en la que se encuentra (Villa, 2022). Tabla 1 Requisitos físicos para el agua purificada Requisito Unidad Min Máx. Método de ensayo Color Pt-Cob - 5 NTE INEN-ISO 7887 Turbidez NTUa - 1 NTE INEN-ISO 7027 Solidos Totales Disueltos Aguas purificadas Envasadas mg/L - 500 2540 solidos Standard Métodos Solidos totales aguas Purificadas mineralizadas Envasadas mg/L 500 1000 2540 solidos Estándar Métodos pH a 20 °C agua purificada envasada 4,5 9,5 NTE INEN-ISO 10523 pH a 20 °C agua Purificada mineralizada Envasada 3,8 9,0 NTE INEN-ISO 10523 Cloro l residual mg/l Ausencia INEN. 977 Dureza t. mg/l. - 300 INEN 974 Unidad en la escala PT-CO = mg/l de platino en forma de cloro platino Unidad nefelometría turbidez (NTU) = 1 mg/L de formazina estándar. Nota: Datos tomados del Instituto Ecuatoriano de Normalización INEN(2017). 9 Tabla 2 Requisitos microbiológicos Requisito Unidad Caso n c m M Método de ensayo Listeria Monocytogenes UFC/100mL 10a 5 0 0 --- ISO 9001:2015 E. coli UFC/100mL 10a 5 0 0 --- NTE INEN-ISO 9308-1 Salmonella UFC/100mL 10a 5 0 0 --- ISO 19250:2013 Nota: Datos tomados del Instituto Ecuatoriano de Normalización INEN(2017). En lo cual: El caso 10ª representa peligro grave incapacitante, pero no amenaza con la vida las secuelas proporcionadas son de corta duración. (c): es el número de muestras admisibles con resultados entre m y M M: es el límite máximo el cual no se acepta. (m): es el límite máximo de aceptación. (n): es el número de muestras a analizar. Las normas de estos entes reguladores se basan en los niveles de toxicidad que deben encontrarse dentro del rango aceptable tanto para personas como animales y animales acuáticos. Para el agua potable estas normas se establecen para asegurar una fuente de agua aséptica y sana para el consumo mediante esta manera se cuida la salud de las personas. El mal tratamiento del agua influye drásticamente sobre la cantidad y calidad del agua de diferentes formas. El agua mal tratada y contaminada no puede utilizarse para el consumo como es el caso de las industrias procesadoras de alimentos y la agricultura son los principales causantes de la contaminación debido a que no tienen un buen tratamiento generando así un sin número de desechos que son vertidos en ríos (Oppliger, 2019). La Agencia Nacional De Regulación Control y Vigilancia Sanitaria (ARCSA) es el ente encargado de verificar el cumplimiento de la normativa en la plantas potabilizadoras y procesadoras de agua embotellada en lo cual en caso de que esta no cumpla con los requisitos específicos ellos se encargan de realizar los análisis microbiológicos para verificar la calidad de este líquido (Edicion Medica, 2021). 10 Figura 2 Calidad del agua Nota: Tomado de Lablouispasteur (2018). 2.1.4. Estándares de calidad para el agua embazada. La (OMS) es el ente encargado de establecer las normas para la calidad del agua purificada y embazada por tal motivo es la base para el decreto de las reglas y seguridad del agua. Los estándares de calidad de cada territorio para el agua se centran en los límites tanto máximos como mínimos para así regular los posibles contaminantes que pueden existir lo cual presentan un debido riesgo de afectar a la salud de todos los que lo consumen por tal razón dependiendo el establecimiento de cada país se adapta de acuerdo a sus posibilidades económicas y ambientales manteniendo controles día a día para así obtener un a agua de calidad (OMS, 2018). Para instaurar los estándares apropiados para el agua purificada la Organización Mundial de la Salud debe establecer una investigación descriptiva y así mismo un análisis que ayude comprobar si los estándares cumplen con su objetivo establecido encargándose así de concretar y definir las normas las cuales son adoptadas e implementadas para algunos territorios a nivel mundial voluntariamente debido a que cada país tiene libre albedrio de concretar e implementar sus propias normas pudiendo ser menores ,iguales o más rigurosas que las establecidas por la OMS (Truque, 2018). Los estándares de calidad para el agua embotellada determinan los límites máximos y mínimos de diferentes aditivos permitiditos en el mismo y sus diferentes requerimientos para su investigación y seguimiento incluyendo contaminantes como microorganismos, pesticidas, así mismos contaminantes tanto orgánicos como inorgánicos (Byram, 2021). 2.1.5. Tipos de agua embotellada. Actualmente existen empresas que producen una infinidad de agua embotellada generando así una pequeña confusión al momento de elegir el embace con el producto 11 por lo que el agua dependiendo la marca es diferente. Cada agua procesada y embazada ya sea mineral natural, ionizada y manantial tienen diferentes características y aportes a nuestro organismo debido a sus tratamientos que pasan hasta llegar al proveedor y ser expendidas, dando a si la opción de elegir de acuerdo a la necesidad del consumidor (Desabad, 2020). Figura 3 Tipos de Agua embotellada Nota: Tomado de Bigstock (2020). Los diferentes tipos de agua embazada no deben poseer colorantes saborizantes extractos o esencias ni azucares que alteren al mismo. El agua purificada, carbonatada, manantial, ionizada y embazada son sometidas a tratamientos fisicoquímicos y de desinfección de microorganismos y son embotelladas con tapas de cierre hermético por lo que son in- manipulables hasta que llegue al consumidor garantizando así que la botella no haya sido destapada después del llenado del líquido y antes de ser comercializadas con el cliente cumpliendo así con los requisitos estipulados por las normas vigentes (NTE INEN, 2008). 2.1.6. Clasificación del agua embotellada. LA FDA cataloga los diferentes tipos de agua embotellada por su origen: Agua de manantial artesiano. Esta agua proviene de un manantial denominado acuífero es decir capas de rocas porosas tanto de arena y tierra que contienen agua encontrándose bajo extrema presión en las mismas. Agua mineral Es proveniente de una fuente subterránea en el cual este líquido contiene un porcentaje de 250 partes por millón de solidos totales disueltos conteniendo minerales 12 oligoelementos provenientes del origen teniendo así muchas ventajas como por ejemplo la reducción de los niveles de colesterol, pero en algunos casos no puede ser ingerida por personas hipertensas o diabetes. Agua proveniente de un manantial. Esta agua nace de una formación subterránea fluyendo de manera natural hacia la superficie recolectándose solo en el manantial y es comercializada con el nombre de Agua manantial siendo esta agua potable por su naturaleza y mediante análisis microbiológicos es adecuada para el consumo y descartando riesgos de contaminación. Agua gasificada. El agua gasificada se llega a obtener mediante un proceso en las plantas de producción en el cual consta de la adicción de una cantidad de ácido carbónico disuelto de acuerdo provocando la reacción de efervescencia todo esto bajo las normativas establecidas vigentes (Desabad, 2020). Su principal ventaja al momento de ingerir esta agua es que ayuda a la secreción de los jugos gástricos mejorando la digestión cuando se consume alimentos pesados. Figura 4 Agua gasificada. Nota: Tomado de: Hammond (2015). Agua tónica. El agua tónica es procesada de manera industrial siendo carbonatada artificialmente agregándole quinina. La quinina es de sabor muy amargo por lo que se le adiciona azúcar hasta nivelar el sabor utilizándose más para coctelería. Bebida a base de agua saborizada. Es una bebida que no contiene gas dándole un ligero sabor y se lo dulcifica con edulcorantes en mínimas cantidades calóricas y en algunos de estos es posible que 13 contengan suplementos adicionales. El consumo de estas bebidas dependiendo el enfoque de beneficio ayudan a la circulación protegiendo así los órganos, eliminación de toxinas, lubricación de articulaciones todo esto basándose bajo la norma para el agua saborizada, envasada y comercializada para el consumo (INTECO, 2022) La presente norma vigente hasta la fecha establece las condiciones que se deben realizar para el proceso de agua saborizada, embotellada y expendida como elaborado final utilizando recipientes de diferentes sustancias y capacidades de volumen destinadas para el consumo de la población diferenciándose de las aguas minerales naturales (INTE A50, 2018). Agua de llave El agua embazada también puede ser utilizada de fuentes municipales siendo tratadas antes del embotellamiento algunos de estos incluyen procesos como son: Ozonización. Según Valdivieso (2022), el agua ionizada es un proceso de potabilización que trata en diluir el ozono en agua actuando como desinfectante para la eliminación de bacterias, virus y diferentes parásitos ayudando así a la micro floculación agrupando los sólidos presentes destacándose por ser oxidante con diferentes potabilizadores. Este proceso es ampliamente utilizado en el tratamiento de aguas tanto potables como residuales debido a que ayuda a la separación de compuestos tanto de nivel orgánico como inorgánico reduciendo así su turbidez, olores extraños, color, sabor así mismo sustancias toxicas que el agua puede contener (Llanos & Condo, 2022). 14 Figura 5 Cámara de ozono para el agua. Nota: Tomado de Fernández (2017). Osmosis inversa La osmosis inversa para el tratamiento de agua se da mediante un proceso físico químico haciéndolo pasar al líquido mediante membranas semipermeables de diferentes tamaños. Logrando así una eficiente separación de solventes de los solutos que en este proceso llevan disueltos, permitiendo así la separación de un 95 % eliminando así las partículas que puede contener (Ferrovial, 2022). Agua mediante proceso de destilación. Mediante el proceso de destilación el agua se desprovee de las sales minerales ,algunos patógenos , electrolitos y posibles sustancias toxicas o dañinas estando compuesta solamente por oxígeno e hidrogeno que pueden contener el mismo .Por lo cual la calidad de este líquido es muy útil en los sectores de hospitales ,laboratorios, e industrias y otras cabe recordar que este líquido no es muy recomendable para el consumo debido al proceso que se lo realiza por la razón de que se eliminan los electrolitos y las sales minales siendo estas las principales que manteen a una persona hidratada (AQUAE, 2021). Agua mediante proceso de filtración absoluta con el uso de micras. En este proceso de purificación el agua atraviesa mediante filtros que pueden ser de una micra eliminado las partículas de mayor tamaño a este, incluyendo dentro de estas partículas del microorganismo denominado cryptosporidium causante de infecciones estomacales. 15 Agua sin procesar. Se caracteriza por no ser tratada ni filtrada siendo embotellándola directamente de la fuente. Las empresas que estén a cargó del procesamiento de agua purificada embotellada tienen el permiso para comercializarlo legalmente siempre y cuando la fuente de donde emerge el líquido este aprobada por los entes regulatorios y que esta cumpla con los diferentes estándares de calidad estipuladas por las normas INEN evitando exceder límites de diferentes sustancias toxicas (Catorce , 2019). 2.1.9. Regulaciones para el agua embotellada. Las medidas establecidas para el agua embazada cumplen ciertos requerimientos indispensables de calidad tanto microbiológicos y físicos químicos una vez hecho se realiza la distribución a los proveedores para que sea comercializada. La norma INEN establece controles regulatorios para mantener los estándares de calidad dando a conocer los limites admisibles de microorganismos, posibles contaminantes y toxinas presentes cumpliendo con los siguientes requisitos: • El agua embotellada ya purificada debe manejar y cumplir las buenas prácticas de fabricación y producción. • El agua embotellada ya purificada debe ser procesada con aguas que cumplas con las Normas Técnicas Ecuatorianos INEN 1108. • No debe presentar sabores extraños ni olores que no sean identificados del producto. • El agua embotellada ya purificada o mineralizada una vez en el envase debe cumplir con los requisitos físicos establecidos. • El agua embotellada ya purificada o mineralizada deberá cumplir con los requisitos microbiológicos establecidos por la presente norma. 2.1.10. Requisitos sanitarios de los procesadoras de agua. La planta debe estar bien estructurada y construida debiendo saber que tanto los cielorrasos, techos, paredes y pisos puedan ser sanitizados con las debidas medidas y mantenidas en perfecto estado. Bebe contar con ventilación para evitar posibles olores ajenos, vapores o gases con toxinas y en lo que es lavado aséptico de las botellas impedir las entradas de polvo o humo. 16 Deberá contar con una distribución adecuada de iluminación protegiendo las áreas de producción siendo siempre luz blanca para evitar alterar los colores. Debe contar con malla milimétrica por los ductos de ventilación y otros evitando así entrada de animales ajenos al mismo. Deberá contar con instalaciones adecuadas asépticas para lavarse las manos y disponer de todos los implementos de limpieza. Debe contar con los comedores y vestidores para el personal de producción ubicándose por separado del área de proceso y almacenamiento. Al momento de ser llenado, tapado, cerrado etiquetado y empacado deben ser rigurosamente realizados de manera escéptica para evitar así contaminaciones cruzadas (Arteaga & Morocho, 2016). 2.1.11. Embotelladoras de agua en la Provincia Bolívar. En la provincia Bolívar en sus diferentes cantones existen empresas que se dedican a la producción de agua embotellada de los cuales tenemos los siguientes: 1. En el cantón Chillanes parroquia san José del tambo se encuentra la empresa ACQUA MIA la cual es dedicada a la elaboración de hielo, bebidas no alcohólicas y agua embotellada. 2. En el cantón Chillanes parroquia san José del tambo en el sector Tombopamba se encuentra la empresa AGUA VITALINA la cual es dedicada a la elaboración de hielo, bebidas no alcohólicas y agua embotellada 3. En el cantón Chillanes parroquia Chillanes se encuentra la empresa AGUA MARIA la cual es dedicada a la elaboración de hielo, bebidas no alcohólicas y agua embotellada 4. En el cantón Chillanes parroquia Chillanes se encuentra la empresa AGUA SAN PEDRO la cual es dedicada a la elaboración de hielo, bebidas no alcohólicas y agua embotellada 5. En el cantón Chillanes parroquia San José del Tambo, ciudadela la Colombia se encuentra la empresa Don Gaibor la cual es dedicada a la elaboración de hielo, bebidas no alcohólicas y agua embotellada 6. En el cantón San Miguel se encuentra la empresa BEBACUA la cual es dedicada a la producción agua embotellada en garrafas. 17 7. En el cantón Chimbo se encuentra la empresa AQUA PURITECH la cual es dedicada a la producción de agua embotellada 8. En el cantón Guaranda, en la parroquia Julio Moreno se encuentra la empresa AGUA CASHAPAMBEÑA la cual es dedicada a la elaboración agua embotellada. 9. En el cantón Guaranda, en la parroquia Santa Fe se encuentra la empresa AQUA SANTA la cual es dedicada a la elaboración agua embotellada. 10. En el cantón Guaranda, en la parroquia Gabriel Ignacio Veintimilla se encuentra la empresa RELIVE “JS” la cual es dedicada a la elaboración agua embotellada. 11. En el cantón Guaranda, en la parroquia Guanujo se encuentra la empresa AGUA BOLÍVAR la cual es dedicada a la elaboración agua embotellada. 12. En el cantón Caluma, en la parroquia Caluma se encuentra la empresa AGUA PARAÍSO la cual es dedicada a la elaboración de hielo y agua embotellada. 13. En el cantón Caluma, en la parroquia Caluma se encuentra la empresa AGUA PURIFICADA EMBAZADA CALUMA la cual es dedicada a la elaboración de hielo y agua embotellada. 14. En el cantón Caluma, barrio la Fortuna vía la Esmeralda se encuentra la empresa AGUA LA FORTUNA la cual es dedicada a la elaboración de hielo y agua embotellada. 15. En el cantón Caluma, recinto san Vicente se encuentra la empresa AGUA CALUMEÑA la cual es dedicada a la elaboración de hielo y agua embotellada. 16. En el cantón Caluma, recinto LA ALSASIA se encuentra la empresa AGUA DEL VALLE la cual es dedicada a la elaboración de hielo y agua embotellada. 17. En el cantón Caluma, en la avenida la naranja se encuentra la empresa AGUA CALUMITA la cual es dedicada a la elaboración de hielo y agua embotellada. 2.2. Biología molecular. Se entiende por biología molecular al ente encargado de estudiar, la composición, funciones, estructuras y las moléculas a nivel celular en los diferentes seres vivos. Enfocándose a investigar y estudiar los diferentes ácidos nucleicos y las proteínas como ADN Y ARN que existen en determinados elementos cumpliendo así funciones como recopilar información genética que estas serán transmitidas por generaciones, logrando 18 ser muy indispensable en diversas áreas de estudio y aplicación por su alta sensibilidad y especificidad al momento de ser analizada en el equipo (García, 2021). 2.2.1. Análisis (PCR) Reacción en Cadena de la Polimerasa en aguas. La (PCR) por sus siglas Reacción en Cadena de la Polimerasa es un método empleado a nivel de laboratorio que permite copias (In vitro) de secuencias específicas de (DNA) ácido desoxirribonucleico de diferentes muestras permitiendo así obtener a partir de una sola muestra millones de copias solamente de un fragmento de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es indispensable en la investigación de la calidad del agua permitiendo así la identificación, detección y caracterización de diferentes microorganismos por lo que al momento de realizar el procedimiento arroja resultados concretos de especificidad y sensibilidad. Para los laboratorios de control de calidad de alimentos y aguas es muy útil utilizar esta técnica por lo que ofrece el análisis a gran escala de muestras obteniendo los resultados de manera rápida, pero así mismo posee complicaciones al momento de realizar maniobras post-PCR a las muestras obtenidas llegando a ser complicado y la indistinción mediante células vivas o muertas que pueden existir en diferentes casos es recomendable realizar procesos convencionales como la preparación de agares para realizar cultivos y así determinar los resultados requeridos (Arcia, 2018). Figura 6 Esquema del Mecanismo PCR. Nota: La figura detalla el proceso de amplificación hasta tener suficientes muestras de ADN. Fuente: Ramirez (2022). 19 2.2.2. Electroforesis Es muy utilizada para la apreciación de fragmentos de ADN o proteínas de productos obtenidos mediante PCR, estableciéndose en la capacidad de las moléculas para la migración de matrices solidas o agares que pueden ser de agarosa o poliacrilamida. Se emplea para poder detectar Listeria, Salmonella, E coli entre otros, después de haber pasado por el método de PCR para evaluar la calidad de las aguas para consumo (Urda, 2018). 2.2.3. Microbiología del agua Para el agua de consumo ya sea embotellada o potable es de vital importancia realizar análisis para la determinación de microorganismos que pueden coexistir en el agua, utilizando y preparando medios de cultivos (agares) para poder identificar la presencia de cada uno de ellos mediante el conteo y la forma que presenta cada patógeno existente. 2.2.4. Microorganismos Los microorganismos son seres pequeños que no pueden ser vistos por el ojo humano y para poder ser estudiados se usan equipos técnicos como microscopios que permiten visualizar detalladamente las formas que tiene cada individuo. Existiendo diferentes tipos de microbios de diferentes formas y tamaños dentro de estas están las bacterias y las arqueas que son unicelulares procariotas, protozoos que son unicelulares eucariotas y membranas como algas y hongos (Álvarez, Reyes, & González, 2018). Diferentes análisis investigativos en biología molecular utilizan los microorganismos para estudiar y entender fenómenos determinados como la obtención de compuestos y los más principales que afectan a la salud mientras que otros son inofensivos y son parte de nuestro cuerpo. En otros casos son tomados en cuenta como de vida libre en la naturaleza encontrándose especialmente en áreas como superficies, tierra, aguas ya sean estas tratadas o residuales (Uriarte, 2020). 2.2.5. Bacterias Son seres vivos que están estructurados por una sola célula es decir son unicelulares con un tamaño de 0,5 y,5 (µm micrómetros) siendo de diversas formas como son tipo espirales, esféricas cilíndricas y helicoidales y reproduciéndose mediante fisión binaria o bipartición es decir de manera asexual como es en el caso de los protozoos, bacterias y arqueas. Se encuentran en todo hábitat desarrollarse especialmente en los suelos, en aguas 20 desechos radio activos, manantiales calientes. De las bacterias que coexisten en el agua tenemos la Pseudomonas aeruginosa, Listeria, Salmonella, Escherichia coli entre otros, siendo esta la más perjudicial para las personas por lo que es la responsable del 90% de infecciones multiplicándose de manera intracelular en protozoos y amebas (Aquafree, 2021). Creciendo normalmente en ambientes con suficiente agua y menos ácidos oscilando con un pH de 4 a 9 pero así mismo se desarrollan en presencia del aire denominándose aerobias mientras que en ausencia del oxígeno crecen las anaerobias, las que pueden desarrollarse y vivir con o sin oxígeno son facultativas y las que pueden vivir con una concentración de aire muy baja son denominadas microaerófilos (OPS, 2022). Los minerales indispensables para que puedan vivir son y hierro, potasio, azufre, calcio, sodio, magnesio y fosforo si se llegaría a tener ausencia de estos minerales el desarrollo y forma de vida se limitan por lo que ya no podrían sobrevivir (Liliana, Lucía, & Diana, 2020). Figura 7 Bacterias presentes en el agua. Nota: Tomado de Castrejos (2021). 21 2.2.6. Bacterias Escherichia Coli Taxonomía Tabla 3 Clasificación Taxonómica de Escherichia coli Taxonomía de Escherichia coli Especie Escherichia coli Familia Entereobacteriaceae Genero Escherichia Clase Gamma proteobacteria Orden Enterobacteria les Filo Proteobacteria Reino Bacteria Dominio Bacteria Tomado de: Castellano (2022). Se encuentra de manera natural en el tracto intestinal de diferentes mamíferos y así mismo en el de las personas encontrándose muy poco en el agua o tierra (suelo) que no haya sufrido contaminación fecal. La presencia E. coli en el agua es una fuente de alarma de una posible y reciente contaminación en las aguas de fuentes naturales provenientes debido a que sufrió una contaminación por la presencia de residuos de animales y personas entrando al medio de diferentes métodos como en la lluvia, patas de animales y derretimiento de nieve llegando así la a las fuentes, ríos y aguas subterráneas, sépticas con algún daño fosas. También puede ser el inicio de un indicativo de la presencia de otras bacterias como virus o protozoos que causan enfermedades (Aconsa, 2022). Escherichia coli con su serotipo O157:H7 es causante de toxinas entre ellas tenemos enterotoxinas, citotoxinas en especial la toxina Shiga o denominada verotoxina son causantes de diarrea sanguinolenta y en algunos de los casos son causantes del síndrome urémico hemolítico daños a los riñones (Vazquez, 2022). Según la Norma Técnica Ecuatoriana del Instituto Nacional De Normalización NTE INEN permite tener los siguientes requisitos microbiológicos para E coli presentada en la tabla 2. 22 Tabla 4 Requisitos microbiológicos para el agua purificada envasada y el agua purificada mineralizada envasada Requisito. Unidad. Caso. n,m c, % m,lim M Metodo de estudio. Recuento de Aerobios Mesófilos UFC/mL 2b 5 2 25 102 NTE INEN-ISO 4833 E. Coli UFC/100 mL 10a 5 0 0 -- NTE INEN-ISO 9308-1 Pseudomonas Aeuroginosa UFC/100 mL 10a 5 0 0 -- NTE INEN-ISO 16266 a Caso, 10, peligro incapacitante, pero no amenaza la vida y la salud, las secuelas son raras duración moderada ICMSF 8. b Caso 2, Utilidad; Contaminación general, menos tiempo de vida útil, deterioro inicial. n. Es el número de muestras a Estudiar. m es el límite de aceptación. M es el límite resaltado el cual no se acepta. c es el porcentaje de muestras admisibles dando resultados entre m y M. Fuente: NTE INEN 2200 (2017). Listeria Tabla 5 Taxonomía de Listeria monocytogenes Taxonomía Dominio Bacteria Genero Listeria Familia Listeriaceae Orden Bacillales Clase Bacilli Filo Firmicutes Fuente: Tomado de: Fernández (2018). 23 La especie de Listeria pertenece a la familia de Listeriaceae misma que se encuentra dentro del tipo de Bacilli y una subdivisión que corresponde a Firmicutes considerándose la especie de Listeria monocytogenes un patógeno de riesgo alto para el ser humano (Gonzalez, 2017) Es un microorganismo que se encuentra en el ambiente como suelo agua, desechos fecales, gramíneas, ganado y plantas pudiendo llegar por esas fuentes especialmente a animales y personas causando listeriosis. L.monocytogenes es virulenta por su resistencia logrando soportar diferentes ambientes por su característica de formar estructuras para protegerse denominados biofilms soportando así desinfectantes y agentes de grado antimicrobiano (Elika, 2021). Tabla 6 Taxonomía Salmonella Taxonomía Reino Bacteria Genero Salmonella. Familia Enterobacteriaceae Orden Enterobacteriales Clase Gammaproteobacteria Filo Proteobacteria Fuente: Tomado de Acosta, Rosarez (2019). Se transmite a través del agua por medio de contaminación de residuos ya sean de animales salvajes, ganado, porcinos, aves o aguas residuales. La especie Salmonella es de genero gramnegativo perteneciente a la familia enterobacteriaceae siendo resistente y sobreviviendo durante mucho tiempo en agua y semanas en ambientes secos (OMS , 2018).Es una bacteria que puede estar presente en alimentos y en aguas contaminadas afectando drásticamente el intestino, siendo la causante de la fiebre tifoidea por el con sumo del líquido vital en malas condiciones y Salmonelosis por comer carnes contaminadas causando especialmente efectos nocivos en el organismo como diarrea, fiebre náuseas y vómitos durando varios días (CDC, 2022) 24 Figura 8 Contaminación por Salmonella. Nota: Tomado de Juárez (2020). 2.3. Tipos de cultivo Los procedimientos de cultivo de microorganismos ayudan verificar y a obtener de manera intencional los patógenos que se desea obtener mismos que se encuentran presentes en los diferentes alimentos y agua. Cuando un cultivo tiene una sola especie de microorganismo de nombra como cultivo puro Oaxénico y si posee diversas especies se denomina cultivo mixto. 2.3.1. Cultivo puro oaxénico Este procedimiento está enfocado en obtener una sola especie microbiana el cual provine de una sola célula obteniéndose en un laboratorio artificialmente teniendo las debidas precauciones asépticas al momento de manejar el procedimiento como ejemplo está el uso de medios selectivos para el crecimiento de un determinado microorganismo (S.A.S, 2022). 2.3.2. Cultivo mixto En un cultivo mixto se desarrollan y viven diferentes especies de microorganismos de forma conjunta. 2.4. Técnicas de cultivo en placa 2.4.1. Técnica por estría en superficie Se deposita el material en la superficie del agar extendiéndolo por la placa con un asa esterilizada. 25 Figura 9 Cultivo por estría en superficie. Nota: Tomado de Miranda (2017). 2.4.2. Técnica de siembra para aislamiento por estría múltiple. Con un asa esterilizada se toma una muestra de cultivo y se extiende por un área pequeña de la superficie de la placa que contiene agar, realizando estrías muy juntas y sin hacer mucha presión para evitar daños en el agar flameando nuevamente el asa y extendiéndolo la muestra nuevamente por otra zona de la placa realizando nuevas estrías teniendo en cuenta que el último tramo para la siembra se lo realizara hacia el interior y se lo incubara siempre en posición invertida. Figura 10 Aislamiento por estría múltiple. Nota: Tomado de Taleno (2020). 2.4.3. Técnica de cuatro cuadrantes. Se divide la placa en cuatro cuadrantes con un rotulador, se ponen los números y se procede con el asa esterilizada a realizar la siembra en forma de estría con la muestra en el agar nutritivo iniciando con el cuadrante 1 hasta llegar al cuatro teniendo como objeto 26 que al menos en uno de los cuatro cuadrantes se encuentren bacterias aisladas (NEUQUEN, 2021). Figura 11 Cultivo mediante cuatro cuadrantes. Nota: Tomado de Neuquen (2021). 2.4.4. Técnica por agotamiento o en superficie. Con el asa previamente esterilizada se procede a depositar una sola muestra en el agar extendiéndolo de forma de estría por toda la placa teniendo como objetó que a partir de un número elevado de microorganismos por el método de la estría se obtiene un número reducido de bacterias distribuidas individualmente en la superficie del agar (JFLAbclinico, 2022). Figura 12 Siembra por agotamiento en superficie Nota: Tomado de JFLAbclinico (2022). 2.4.5. Técnica de siembra masiva. Esta técnica es recomendable por lo que permite obtener un elevado número de microorganismos en un medio de cultivo empleando un hisopo estéril el cual se pasa por la superficie del agar nutritivo de una placa en diferentes direcciones y para finalizar se lo realiza por los bordes para así garantizar el desarrollo total de los microorganismos (NEUQUEN, 2021). 27 Figura 13 Siembra masiva en placa. Nota: Tomado de Miranda (2020). 2.4.6. Técnica de siembra por punción. Es utilizado para la observación del crecimiento de los microorganismos y con el tiempo se estudiará su morfología o así mismo para el subcultivo de cepas que fueron almacenadas y conservadas en el cual con el uso de una asa micológica o asa recta se toma parte de la muestra y con una punción leve en el centro del agar, pero sin tocar el fondo de la caja Petri se deja inocular el microorganismo que se estudiara (Reynoso & Magnoli, 2022). Figura 14 Siembra por punción en placa. Nota: Tomado de Baixar (2016). 2.4.7. Técnica de siembra por dilución Se inicia con la muestra inicial del cual de desea estudiar y los tubos de ensayo con el porcentaje exacto de agua estéril que es solvente para la dilución empezando con la adición de una cantidad exacta de la muestra para dilución en el tubo inicial y se agitara en un vibrador para su respectiva homogenización, y con un a pipeta estéril se toma la cantidad específica del primer tubo y de deposita en el segundo se homogeniza y se repite el caso dependiendo la dilución esperada realizado todo este procedimiento con la 28 dilución final se inocula un porcentaje exacto en las placas de cultivo con la ayuda de una asa digrasky se distribuye en la placa para su cultivo y se incuba dependiendo la temperatura y el tiempo para el microorganismo a estudiar (German, 2022). Figura 15 Siembra por dilución Nota: Tomado de Barros (2022). 2.5. Técnicas de siembra para tubos. 2.5.1. Siembra en tubos por estría simple. Esta técnica se realiza en un tubo con un medio agar solido inclinado en bisel y se desliza el asa en la superficie de manera que se hagan en forma de surcos o estrías (Quenta, 2020). Figura 16 Siembra en tubos por estría simple. Nota: Tomado de Barros (2022). 2.5.2. Siembra en tubos por picadura. Esta técnica se realiza en un tubo con medios sólidos y semisólidos sin inclinar con el asa recta; en el cual con el asa esterilizada ya con la muestra se introduce el 29 microorganismo al medio por el centro de la superficie del tubo hasta llegar al fondo del tubo evitando tocar las paredes. Figura 17 Siembra por picadura en tubo. Nota: Tomado de Taleno (2020). 2.5.3. Siembra mixta en tubos Esta técnica se realiza en tubos con medios solidos o semisólidos inclinados o bisel, realizando una picadura con el asa ya con la muestra por el centro de la superficie hasta llegar al fondo del tubo y la otra siembra se lo realiza en la superficie en forma de estrías o surcos realizando así dos siembras (Barrera, 2019). Figura 18 Siembra por picadura y estría. Nota: Tomado de Barrera (2019). 2.5.4. Siembra por inoculación o agitación. Con el uso de un asa previamente esterilizada se toma la cantidad de la muestra a estudiar se introduce en el centro del medio de cultivo liquido agitándose con dos o tres movimientos de manera circular y tratando de no tocar las paredes del tubo, se retira el asa del tubo y se lo esteriliza para eliminar los microorganismos que hayan quedado adheridos al asa. (Reynoso, 2022). 30 Figura 19 Siembra por agitación. Nota: Tomado de Barrera (2019). 2.6. Tipos de medio de cultivo según su función. 2.6.1. Medio general Se caracteriza por lo que en este medio pueden crecer todo tipo de microorganismo que se desea estudiar. 2.6.2. Medio selectivo. Se caracteriza por contener algunos nutrientes específicos y su función principal en este medio es que crezcan un solo tipo específico microorganismos por ejemplo si se desea aislar Salmonella se puede utilizar este medio para inhibir el crecimiento de otros microorganismos (Beltran, 2022). 2.6.3. Medio diferencial Este medio de cultivo permite la diferenciación e identificación de una especie de otra en el mismo medio de cultivo dependiendo el tipo de metabolismo que los microorganismos contengan llevando un indicador que permite observar la diferenciación del mismo (Viresa, 2021). 2.6.4. Medio de enriquecimiento o nutritivo. Posee los nutrientes necesarios para que puedan crecer diferentes especies de microorganismos consiguiendo que en este medio se logre la proliferación máxima de las diferentes especies entrando extractos especialmente de carne, sangre y levaduras con peptonas en lo cual no contiene agentes inhibidores dando lugar así para que crezcan diferentes especies incluyendo microorganismos exigentes (Gil, 2019). 31 2.6.5. Medio mínimo. Este medio nutritivo contiene la cantidad mínima de nutrientes los cuales son indispensables para que pueda crecer una especie determinada de microorganismos sin la presencia de aminoácidos o manteniendo muy pocos (Arumi, 2022). 2.7. Tipos de agar Son medios de cultivo que contienen un conjunto de nutrientes que ayudan a tener condiciones adecuadas y necesarias para el desarrollo de los diferentes microorganismos que se desea estudiar de los cuales los más utilizados son: 2.7.1. Agar/Caldo LB (Luria Bertani) o Agar caldo Millers LB. Este agar es un tipo de medio de cultivo nutritivo que no es selectivo ni diferencial, posee triptona, extractos de levadura y cloruro de sodio NaCl, contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de la materia de microorganismos (Rovira, 2022). 2.7.2. Agar sangre. Este tipo de agar es un medio diferencial enriquecido conteniendo la combinación de un agar de sangre de animales mamíferos como oveja, conejo o en ocasiones humanos con un nivel de concentración de 5-10%; utilizándose para el aislamiento de microorganismos como Streptococcus dentro de estos S. pyogenes y S. aureus. Por lo cual es diferencial para detectar actividad hemolítica (lisis y digestión de eritrocitos) las bacterias pueden hacer B-hemolisis que es una lisis completa y se podrá apreciar un halo incoloro al contorno de la colonia o una α-hemolisis (hemolisis parcial) apareciendo un halo se colores verdosos alrededor de la colonia (Monteiro, 2019). 2.7.3. Agar chocolate Este tipo de medio es un agar de sangre que se ha realizado un método de calor para que los glóbulos rojos cambien a color marrón dando así una coloración a chocolate. Se emplea para el aislamiento de Haemophilus influenzae y Neisseria meningitis, al momento de la incubación se liberan glóbulos rojos que son necesarios para le crecimiento de los microorganismos (Ñuñoa, 2018). 2.7.4. Agar MacConkey Este agar es un medio diferencial y selectivo creciendo bacterias gram negativas como aerobias y anaerobias facultativas incluyendo a todo el género Enterobacteriaceae, 32 Inhibiendo el crecimiento de bacterias gram positivas por lo que contiene sales biliares y cristal violeta. Este medio es diferencial porque ayuda a detectar bacterias que fermentan la lactosa como (Escherichia coli, klebsiella) acidificando el medio y que las colonias y el medio tomen un color característico rosado o rojizo, en el caso de que exista presencia de (Salmonella, Proteus, Yersenia) no habrá un cambio de color por lo que estas especies no degradan la lactosa (Prieto, 2022). 2.7.5. Agar sabouraud Este medio agar es empleado para el cultivo de hongos por lo que contiene una alta concentración de dextrosa y con un pH bajo logrando con esto la inhibición de la mayoría de las bacterias y también posee gentamicina que es un antibiótico que impide el desarrollo de bacterias gram negativas (Poincare, 2019). 2.7.6. Agar entérico de hektoen. Este agar es un medio diferencial y selectivo especialmente para bacterias gram negativas como Salmonella y Shigella debido a que posee un indicador de pH en el cual las bacterias que acidifican el medio de cultivo hacen que el agar se toné de color amarillo o rojo y los microorganismos que lo alcalinizan el agar lo vuelven de color azul, permitiendo así la diferenciación de bacterias por la presencia de Tiosulfato como es en el caso para Salmonella que se forman colonias de color negro por la producción de ácido sulfúrico (Rossy, 2021). 2.7.7. Agar Müller -Hinton. Este agar es un medio no selectivo con extractos de triptona, almidones carne e infusiones permitiendo el crecimiento de la mayoría de microorganismos, utilizándolo para pruebas con antibióticos y antimicrobianos debido a que la formula del agar no se encuentra tan concentrada permitiendo así la difusión de los antimicrobianos (Britania, 2021). 2.7.8. Agar Xilosa -Lisina-Desoxicolato (XLD). Este medio de cultivo es de tipo selectivo y diferencial para Salmonella, Shingella el cual es adecuado para el aislamiento de estos microorganismos de categoría Gram negativos que son tolerantes a las sales biliares, teniendo así un color característico rojo fenol ayudando a diferenciar las colonias de color rosa pálido. Además, contiene citrato de hierro y amonio el cual permite que se pueda espectar los microorganismos productores de ácido sulfhídrico como son colonias con centros de color negro (Valdes, 2021). 33 2.7.9. Agar verde brillante Este medio de cultivo es de tipo selectivo y es utilizado especialmente para el aislamiento de Salmonella a excepción de Salmonella typhi y S paratyphi.El característico color actúa como un agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Gram positivos y así mismo de algunos Gram negativos, los principales hidratos de carbono que ayudan a fermentar son la lactosa y la sacarosa y el rojo fenol es el que indica el pH que cambia a color amarillo cuando existe una producción del ácido sulfhídrico cuando las azucares se fermentan (Rossi, 2021). 2.7.10. Agar triptona -soja (TSA) Este medio agar es producido por la digestión enzimática de soja y caseína es de uso general y está enfocado especialmente para el crecimiento de un amplia variedad de especies incluidas dentro microorganismos aerobios y anaerobios, se lo puede utilizar en caja Petri ya sea liquido o solido teniendo una función variada como es en la obtención de cultivos puros o con medios de enriquecimiento para obtener más cantidad o así mismo se lo utiliza para él estudió de las morfologías de las colonias, creciendo en este medio microorganismos de especies alarmantes como Listeria, Brucella, Corynebacterium Neisseria y Vibrio (Winkler, 2020). 2.7.11. Listeria agar cromogénico Este medio de cultivo es preparado con suplementos selectivos y diferenciales como son peptona de carne y triptona así mismo contiene cloruro de litio, polinixina, ácido nalidixico y anfotericina esta actúa inhibiendo los demás microorganismos, utilizándose especialmente para el aislamiento e identificación de la especie que se encuentran presentes en diferentes alimentos para consumo. La beta- glucosidasa es la enzima que se encuentra presente en las especies de Listeria y mediante reacciones, combinaciones enzimáticas cromogénicas y de fosfolipasa se puede apreciar en un cultivo las dos especies como Listeria monocytogenes que son colonias azules rodeadas por un halo opaco y Listeria spp se diferencia por contener sus colonias de color azul sin halo opaco (Thermofisher, 2021). 34 CAPITULO III 3. MARCO METODOLÓGICO 3.1.1 Localización de la investigación Este proyecto investigativo se llevó a cabo en la Universidad Estatal de Bolívar, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Recursos Naturales y del Ambiente, Carrera de Agroindustrias, instalaciones del Departamento de Investigación Laguacoto II. Tabla. 7 Aspectos generales del territorio Parámetro Valor Altitud 2.630 msnm Latitud 01°36'52''S Longitud 78°59'54''W Temperatura máxima 21°C Temperatura mínima 7°C Temperatura media 14,4°C Precipitación media 980 mns Heliofanía(H/L) /año 100 Humedad relativa 70% Velocidad promedio del viento 6 m/s Fuente: Puga (2021). 3.1.2. Situación geográfica y climática. Tabla 8 Datos de la situación climática y geográfica. Parámetro Valor Altitud 2.622 msnm Latitud 01°36'15''S Longitud 78°59'54''W Temperatura mínima 7°C Temperatura media anual 14.4°C Temperatura máxima 21°C Humedad Relativa promedio 75% Precipitación media anual 980 mm Heliofanía promedio 900/horas/luz/año Nota: Estación Meteorológica Laguacoto II. UEB (2021). 35 3.1.3. Zona de vida El lugar donde se lleva a cabo la investigación corresponde a una zona de vida denominada bosque húmedo montano bajo (BHMB). Según lo propone y lo clasifica el botánico climatólogo L. Holdridge. 3.2. Materiales 3.2.1. Material experimental. 1 muestra de agua embotellada de una unidad de 1000 mL de las 16 empresas procesadoras de agua para consumo que comercializan el producto la Provincia Bolívar. 3.2.2. Materiales de oficina. • Esferos • Lápices • Borrador • Hojas papel bond A4 • Calculadora • Computadora portátil • Carpetas • Cuaderno para apuntes • Portafolio • Memoria Flash 3.2.3. Materiales de Laboratorio. • Botellas de vidrio. • Mechero bunsen • Estrías para siembra • Placas Petri • Agares para cultivos • Bomba eléctrica para membrana • Pipetas • Micropipetas y material de aspiración • Fundas herméticas • Tubos de ensayo 36 • Probeta • Vasos de precipitación • Guantes • Alcohol • Algodón • Gradillas • Tubos de ensayo • pH metro • tubos Durham • Microtubos eppendorf • Gradillas eppendorf • Portaobjetos • Beaker de 250 mL 3.2.3. Equipos • Incubadoras • Balanza digital • Agitador vortex • Termómetro • Termociclador PCR. • Transiluminador • Cuba hidroneumática • Espectrofotómetro Reactivos para tinción de gram • Violeta de genciana • Lugol • Alcohol al 70% • Acetona • Tinción de safranina o fucsina • Aceite de inmersión Reactivos para Reacción De Cadena Polimerasa (PCR). • GoTaq Green Master Mix, 2x. 37 • Agua libre de nucleasas • Cebadores o primers forwar y reverse. • Kit de extracción ADN. 3.3. Métodos 3.3.1. Factores en estudio De acuerdo a las particularidades de la investigación propuesta se plantea desarrollar los siguientes factores para los cuales se definen a continuación: Factor A: Localidades Factor B: Método de análisis Tabla 9 Factores de estudio Factor Código Niveles Localidades A a1: Chimbo a2: Guaranda a3: San Miguel a4: Caluma a5: Chillanes Método de análisis B b1: Análisis Biomolecular PCR b2: Cultivos Nota: Trabajo experimental. 3.3.2. Tratamientos Los tratamientos son derivados de los factores de estudio utilizándose estos como referencia para el desarrollo de la investigación detallándose en la siguiente tabla: 38 Tabla 10 Tratamientos Tratamientos Código Tratamientos A B 1 a1b1 Chimbo Análisis Biomolecular 2 a1b2 Chimbo Cultivos 3 a2b1 Guaranda Análisis Biomolecular 4 a2b2 Guaranda Cultivos 5 a3b1 San miguel Análisis Biomolecular 6 a3b2 San miguel Cultivos 7 a4b1 Caluma Análisis Biomolecular 8 a4b2 Caluma Cultivos 9 a5b1 Chillanes Análisis Biomolecular 10 a5b2 Chillanes Cultivos Nota: Trabajo experimental. 3.3.3. Características del experimento. Correspondió a la siguiente tabla informativa: Tabla 11 Características del diseño Atributos Del Diseño Factorial Numero de factores experimentales (Fe) 2 Numero de tratamientos (t) 11 Numero de repeticiones (r) 3 Número de unidades experimentales (txr) 33 Tamaño de unidad experimental. 1000 mL Nota: Trabajo experimental. 3.3.4. Tipo diseño experimental o estadístico. Se aplicará un diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial A x B (5 x2) con tres repeticiones. Así mismo se aplicará un análisis de varianza (ANOVA) para 39 establecer las diferencias entre los tratamientos el cual está reflejado en el siguiente modelo: 𝒀𝒊𝒋𝑲 = 𝝁 + 𝑨𝒊 + 𝑩𝒋 + (𝑨𝑩)𝒊𝒋 + 𝑬𝒊𝒋𝒌. Donde: YijK: Variable sujeta a medición μ: Representa la media global Ai: Es el efecto del factor A Bj: Efecto del factor B (AB)ij: Efecto de la interacción A x B Eijk: Efecto Del Error Experimental Aleatorio. Tabla 12 Modelo de Análisis de varianza ANOVA. F.de Viabilidad S. Cuadrados Grados de libertad Cuadrado medio Fexp Valor de P Factor A SCA a-1 CMA CMA/CME P(F>𝐹0 𝐴) Factor B SCB b-1 CMB CMB/CME P(F>𝐹0 𝐵) Factor AB SCAB (a-1) (b-1) CMAB CMAB/CME P(F>𝐹0 𝐴𝐵) Error SCE ab(n-1) CME Total SCr abn1 Nota: Tomado de Gutiérrez (2008). 3.4. Métodos de evaluación y datos a tomarse. 3.4.1. Variable de respuesta. • Concentración de bacterias Se lo hace para evaluar el estado del agua embotellada verificando así la presencia o ausencia de bacterias como E. Coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. garantizando así la eficacia del proceso de tratamiento de las aguas destinadas al consumo humano e indicando así el nivel limpieza y el estado de los sistemas de distribución basándonos bajo la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 2200 2017. 40 3.5. Georreferenciación Este método permite expresar la posición exacta o relativa de un punto en la superficie de la tierra en lo cual consiste en la localización geografía mediante coordenadas especificas ubicando los lugares y direcciones exactas dentro de un mapa digital con el objeto de identificar cada una de las procesadoras de agua embotellada que se encuentran en la provincia Bolívar para lo cual el método a utilizar para tener una muy buena precisión será de un GPS el mismo que permitirá dar los puntos exactos de los lugares. Al realizar la Georreferenciación se logrará: • Conocer las coberturas geográficas en donde se encuentran las empresas expendedoras. • Entender las ubicaciones con coordenadas y referencias del lugar donde realmente se encuentran las empresas. 3.5.1. Recolección de datos Mediante la recolección de datos se asegurará que la información sea confiable de cada una de las muestras analizadas según los resultados de los análisis cuantitativos obtenidos haciéndola de manera precisa con exactitud para así evitar errores para lo cual se utilizará el Software Excel. 3.6. Manejo del experimento. 3.6.1. Obtención De Muestras. Para evitar confusiones en el manejo de esta investigación se lo realizo bajo reglas específicas detallándose a continuación: Las muestras de agua se obtuvieron en las diferentes empresas procesadoras de agua embotellada de la provincia Bolívar encontrándose en Caluma, San Miguel, Guaranda, Chimbo, Chillanes y Echeandía para luego ser trasladadas al departamento de investigación de la Universidad Estatal de Bolívar donde se realizará los respectivos análisis propuestos por esta investigación. 3.6.2. Codificación e identificación de las muestras Las 17 muestras agua embotellada a analizar se codificarán para poder identificarlas como la fecha que se visitó la planta para el muestreo y de acuerdo a la marca nombre de la empresa y lugar para un mejor manejo de cada una de ellas. Especificándose de la siguiente manera marca, número, fecha y localidad para identificar la muestra. 41 3.6.3. Registro de las muestras. Una vez tomada las muestras en las plantas procesadoras de agua embotellada se procederá el registro de las muestras colocando etiquetas para el rotulado en los envases tomando como base principal la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 2176:1998 catalogada como calidad de agua y técnicas de muestro en la cual menciona que deben incluirse por lo menos los datos siguientes para el informe de muestreo: • Localización y nombre del lugar de muestreo. • Detalles del punto de muestro fecha de la recolección. • Método de recolección. • Hora de recolección. • Nombre del recolector. • Condiciones atmosféricas. • Naturaleza del pretratamiento. • Preservante o estabilizador adicionado. • Datos recogidos en el lugar. Tabla 13 Codificación, identificación registro de las muestras y origen. Código Origen, Cantón Cantón Lugar de procedencia Hora T1 San Miguel 1000 mL Av. Veintimilla y 10 de enero 9:00 am T2 Guaranda 1000 mL Santa Fe a una cuadra del centro AYA UMA 3:15 pm T3 Guaranda 1000 mL Guanujo; 4 Esquinas 12:32 pm T4 Guaranda 1000 mL Julio Moreno Recinto Cashapamba 10:14 pm T5 Guaranda 1000 mL Simiatug 13:24 pm T6 Guaranda 1000 mL Alpachaca Sector UEB 2:30 pm T7 Chimbo 1000 mL Tamban ciud. Santa Marianita 10:14 pm 45 T8 Caluma 1000 mL Vía Montalvo- Recinto Tablas De La Florida 2:00 pm T9 Caluma 1000 mL Caluma vía Guaranda a 100 metros de hostería Madera fina 11:12 am T10 Caluma 1000 mL Rec. La Alsacia vía el santuario de la virgen. 10:30 am T11 Caluma 1000 mL Calle: Anacarcis Camacho 1091 Av. La naranja 12:23 pm T12 Caluma 1000 mL Vía a Charquiyacu Recinto san Vicente 11:00 am T13 Caluma 1000 mL La Fortuna S/N Vía A La Esmeralda, Cerca El Complejo Deportivo La Roca 1:05 pm T14 Chillanes, San José del Tambo 1000 mL San José del Tambo (Tambopamba), vía San Vicente 10:30 am T15 Chillanes, San José del Tambo 1000 mL Recinto la Colombia, junto al subcentro de salud 11:29 am T16 Chillanes, San José del Tambo 1000 mL Recinto Nuevo Porvenir 2:15 am T17 Chillanes 1000 mL Quilayaco Calle: Continuación Regulo De Mora 10:10 am 46 T18 Chillanes San José del Tambo 1000 mL Frente a la escuela Colombia Alta 2:30 pm 19 Caluma 1000 mL Vía al valle 2:50 pm Nota: Trabajo experimental. 3.9. Análisis Microbiológicos 3.9.1. Aislamiento de E. Coli Se preparo el agar Mac Conkey para determinar si existe la presencia E. Coli en las aguas embotelladas. Este agar está compuesto por sales biliares y cristal violeta que impiden el crecimiento de patógenos Gram positivos a si mismo contiene lactosa y el indicador de pH rojo neutro que permiten la apreciación de los microorganismos. Para lo cual, en su preparación se pesó 12 gramos de agar y se depositó en 255 mL de agua destilada y se homogenizo hasta que la mezcla este completamente hecha posteriormente se dejó reposar durante 10 minutos, luego se depositó en un envase de laboratorio con imanes giratorios para poner en una plancha de agitación con calentamiento para que se disuelva por completo el agar hasta el punto de ebullición iniciando en número 4, y se lo deja reposar hasta una temperatura de 40°C , seguidamente se incorpora en las placas petri y se deja enfriar. Posteriormente se trabajó mediante el método filtración por membrana bajo la Norma Técnica Ecuatoriana INEN-ISO 9308-1 en lo cual, de las 11 muestras de agua embotellada se extrajo 100 mililitros de cada una de ellas previamente puestas las membranas (CHM, MPV045047H, España) se depositó en el embudo Buchner de la rampa de succión para filtración y se filtra. Posteriormente se retiran cuidadosamente las membranas con el uso de pinzas y se depositara en las cajas petri previamente rotuladas con el medio de cultivo para cada una de las muestras, y se lo procede a encubar a las temperaturas de acuerdo a las condiciones de cultivo. Luego de ser incubados bajo aerobiosis las colonias características de Escherichia Coli fermentaron la lactosa dando características de colonias rosas o 47 rojizas para confirmar se inoculo en el medio Bilis Verde Brillante en lo cual se utilizó el método de la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1529-6 en lo cual se dejó incubar a 37.5°C por un periodo de 24 horas en caso de que salga negativo se incubara durante 24 horas más y luego se determina y analizara mediante la tinción de Gram. 3.9.2. Aislamiento de Listeria. Para determinar si existía la presencia Listeria en las aguas embotelladas se utilizó Aloa Listeria, Agar Base (ISO 9001-1:2015.) Este medio está compuesto por peptona de carne encontrándose dentro de estas los nutrientes necesarios para el desarrollo así mismo contiene extractos de levadura la cual genera la vitamina B. El piruvato sódico actúa como fuente de energía la cual ayuda a verificar al patógeno. El Ácido Nalidixico, Polimixina, Cloruro De Litio, Cicloheximida y Deftazidima ayudan a que el medio sea selectivo. Este sustrato detecta la enzima B-glucosidasa la cual está presente en los géneros de Listeria colorando sus colonias de azul. El sustrato de Lipasa es la aureola de un color característico blanco opaco que este alrededor de la listeria azul (ISO 11290- 1:2004, 2012). Para su preparación se pesó 18 gramos de Aloa Listeria, Agar Base ( L. Mono diferencial Agar Base) se depositó en 255 mL de agua destilada y se homogenizo hasta que la mezcla este completamente hecha posteriormente se traslada a la plancha de agitación con calentamiento para que se disuelva por completo el agar hasta el punto de ebullición iniciando en número 4,luego se lo llevo al autoclave a 121°C durante 15 min y se lo deja bajar hasta una temperatura de 45 a 50°C .Seguidamente de incorpora se en las placas petri y se deja enfriar. Seguidamente se trabajó mediante el método filtración por membrana bajo la Norma Técnica Ecuatoriana INEN-ISO 9308-1 en